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团聚物的拓扑结构在决定其基因传递效劳方面起着要害作用。因此，探索新的团聚物结构算作基因传递载体具有热切的敬爱敬爱。安徽理工大学/齐柏林大学王文新教悔团队初次通过道路滋长团聚表率合成了具有独到拓扑结构的新一代多环聚（β-氨基酯）s（CPAEs）。通过扫尾环化的发生阶段足球比赛押注平台推荐，获取了三种不同大小和拓扑结构的环的CPAEs。体外实践标明，与具有大环的基因比较，具有大环的CPAEs（MCPAEs）权臣训诫了转基因的抒发。此外，具有优化终局基团的MCPAE载体有用地传递了编码金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶和双换取sgRNAs的CRISPR质粒，用于基因剪辑颐养。联系推敲后果以“3D Macrocyclic Structure Boosted Gene Delivery: Multi-Cyclic Poly(β-Amino Ester)s from Step Growth Polymerization”为题于2023年7月25日发表在《Journal of the American Chemical Society》。

在本推敲中，应用充分推敲的季戊四醇四丙烯酸酯（PTTA）和5-氨基1-戊醇（S5）算作主单体（透露图1A），规画了三种道路式滋长团聚（SGP）政策来颐养三种不同环结构合成CPAEs的成环能源学（决策1B−D）。

透露图1 由不同的SGP表率产生的三种类型的CAPEs的化学结构和造成机理的透露图

【合成尺寸环CPAEs的SGP政策】

环化经过的进展如图1A、B所示。当团聚物分子量（MW）接近二聚体时，63%的乙烯基被滥用，1h内的GPC踪迹如图1A、图1B红色虚线所示）。这个反应进度远远高于表面二聚体假定莫得环化反应44%的其他两种表率（图1C、F），标明在表率1中，在早期通过环化滥用了更多的乙烯基。跟着团聚物链的滋长，获取了具有不同尺寸的环（跟着团聚经过的进行而冉冉增大）的CPAEs（称为SMCPAE）。上述团聚经过如图1D所示。唯有两个相距较远的官能团约略通过构象变化互相宣战和反应，从而产生宏不雅环（称为MCPAE）。通过该表率，获取了CPAE-3进行表征（图1E中的2.5h）。

图1 比较三种不同的SGP政策在三种CPAEs造成经过中的团聚活动

【CPAE-1、CPAE-2和CPAE-3的结构表征】

聚簇触发辐射（CTE）的机制标明，CPAEs/HPAE中氧/氮原子之间的间距小于其范德瓦尔斯半径之和，导致有用的电子互相作用，导致非共价键的空间离域，延长有用共轭距离（图2D）。当在一张图像中不雅察三个CPAEs的PL图时，不错不雅察到它们的荧光活动之间的彰着区别，从CPAE-1到CPAE-3不错不雅察到越来越权臣的红移峰（图2E）。跟着环尺寸的增大，更多的孤电子对基团将固定在更密集的环结构中，阐扬出更多的红移辐射（图2F）。因此，与CPAE-2和-3比较，CPAE-1（由表率1制备）的小环结构不错通过ca325nm处的主要荧光峰来反馈出来（图2A、F）。而在CPAE-2中也存在多半的中型环，这标明在ca430nm处出现了一个长波长的荧光峰（图2B、F）。关于CPAE-3C，它在ca450 nm处阐扬出一个主要的长波长辐射峰，阐明了宏不雅环在其轮回结构中占主导地位（图2C、F）。

CPAE-1到CPAE-3的1H−1H联系光谱（COSY）光谱泄露，CPAE-1和CPAE-2上的g（Hg）质子与E7上的b（Hb）质子耦合（图3A），这意味着CPAE-1和CPAE-2的终局基团和骨干之间有很强的空间互相作用（图3B）。总联系光谱（TOCSY）泄露了在CPAE-1和CPAE-2中，Hb（E7）和Hg（S5）上的更动耦合峰；然而，在CPAE-3的相应区域莫得不雅察到这种互相作用（图3C）。这些扫尾标明，CPAE-1和CPAE-2的大部分终局基团镶嵌在CPAE骨干中，而以大环为主的CPAE-3，其大部分终局基团向外蔓延，因此莫得不雅察到与骨干结构的互相作用。

图2 三种CPAEs的不同荧光风物过头作用机制

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图3 CPAE-1到CPAE-3的2D-核磁共振谱

【大环结构促进的基因转染】

与CPAE-1、CPAE-2和HPAE比较，团聚物/DNAw/w为120：1的CPAE-3在HEK细胞中的转基因抒发辞别训诫了21倍、18倍和138倍（图4A）。此外，即使在最高的团聚物/DNA分量比（w/w = 200：1）下，整个细胞系中也莫得不雅察到细胞毒性（进步90%的细胞活力）（图4B、D、E）。

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PicoGreen检测扫尾泄露，整个PAEs的DNA联结效劳均达到80%以上（图5A）。天然不同的PAEs的DNA联结效劳一样，证据动态光散射（DLS）评估，暂停的轮回结构权臣匡助浓缩复合大小比较分支结构同期保抓高zeta后劲（图5B、C）。此外，CPAE多聚物的尺寸跟着相应团聚物的环尺寸的增多而减小（图5C）。不同PAEs造成的多聚体大小的变化标明CPAEs的DNA缩合智商更强，畸形是MCPAE。接下来还推敲了不同PAEs的多聚体的CTE活动（图5D−F）。与PAE团聚物的荧光比较，其多聚物的荧光齐裁汰了（图5D−F）。这些发现标明，环状结构，畸形是宏不雅环状结构（MCPAE），更有益于纳米级复合体的造成。证据Cy3标志DNA的荧光信号，不错看到细胞内对宏环CPAE-3的给与远远进步其他PAEs；在搞定4h后，它是SCPAE（CPAE-1）和HPAE-1的4倍以上（图5G）。由于MCPAE核的强度更强，CPAE-3在醋酸钠溶液中的降解速率比其他PAEs要慢得多（图5H）。由于MCPAE的结构更牢固，基于CPAE-3的多聚体阐扬出最慢的开释速率，在酸性条目下阐扬出其最好的DNA保护智商（图5I）。

从图6A、B中不错看出，在保抓80%以上的DNA包装效劳和高名义电位的同期，跟着宏不雅环化进度的增多，多聚体尺寸从MCPAE-0到MCPAE-72 h减少了70%。同期，从MCPAE-0到-72 h，复合体的给与效劳训诫了16倍以上（图6C）。转染MCPAE-72 h后的GFP抒发比MCPAE-0h增强了230倍，从分支结构过渡到大环结构，同期保抓了进步90%的细胞活力（图6D、E）。这些扫尾进一步诠释了CPAEs中大环结构的掺入有益于DNA包装、细胞给与、DNA保护以及最终的基因转染。

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图4 体外评估不同轮回类型的CPAEs的基因转染性能

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图5 转染要害阶段不同轮回型CPAEs的理化特征

图6 体外评价不同大环限制（0~72h）的MCPAEs的基因转染性能

【高效MCPAE基因传递载体的缔造过头在基因颐养中的应用—终局优化】

基于表率3构建了隔断于不同终局含胺基团的MCPAEs，领先对不同碳链长度的低级氨基进行评估（图7A）。图7B中的转染扫尾泄露，跟着终局碳链的延长，隔断的MCPAEs的转染效果冉冉训诫，并达到了终局基团C的最高性能。与HPAE-A到HPAE-D比较（图7C），MCPAE-A对MCPAE-D的转染性能要好得多，即使在最好HPAE/DNA w/w比（200：1）下，MCPAE-C也达到HPAE的4倍。MCPAE-G的GFP抒发量最高，进步了整个买卖药物（图7D）。且三种MCPAE确凿莫得细胞毒性，泄露了它们在高效和安全的基因颐养方面的后劲（图7E）。

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图7 不同终局基团的MCPAEs和HPAEs的转染性能

【MCPAE介导的基因颐养隐性大疱性养分不良表皮松解症的体外评价】

颐养性基因传递的主要阻难是它们的大序列大小，如CRISPR-EXON80质粒（图8A）。图8B的扫尾泄露，与MCPAE-C和MCPAE-M比较，MCPAE-G在测试的团聚物/DNA分量比限制内（从80：1到200：1），在保抓高细胞活力的同期，阐扬出了更好的转染性能。因此选择了MCPAEG多聚体，并进一步应用于免疫细胞化学的Cas9的产生和定位推敲（图8C）。在转染了CRISPR-EXON80质粒的HEK293细胞中，预期的剪辑条带阵势很彰着，而在对照DNA中莫得不雅察到这种情况（图8D）。对Sanger测序扫尾的CRISPR Edits（ICE）分析也阐明了25%的DNA序列中存在58 bp的片断缺失（图8E）。

图8 MCPAE介导的体外基因剪辑评估

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【追念】

本文建议了一种新的环化阶段扫尾政策（表率1、表率2和表率3）来颐养不同SGP阶段的环化趋势。该政策约略以可控的状貌构建三种具有不同环尺寸和轮回拓扑结构的3D多轮回PAEs。三种CPAEs具有独到的拓扑特征（包括不同的环类型和端群散布等），并初次用荧光光谱法和2D-NMR法进行了考据。三种CPAE的基因转染扫尾泄露，与其他CPAE和HPAE比较，大环PAE（MCPAE）过头多聚体权臣增强了DNA凝结、细胞给与、DNA保护，从而训诫了转染基因的抒发。阐扬最好的MCPAE-C、-G和-M比最好的买卖试剂Lipo 3000、jetPEI和Xfect具有更高的转染效劳。此外，应用优化终局基团的MCPAE，高效寄递编码金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶和双换取sgRNAs的CRISPR-EXON80质粒，用于体外基因剪辑。本推敲的发现为今后高效非病毒团聚基因传递载体的发展提供了有价值的视力。

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c04191

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